脯氨酸(Pro)作为一种植物蛋白质组分主要以游离状态广泛存在于植物体中(全先庆等, 2007)。在干旱、高盐碱等逆境条件下，植物体内脯氨酸往往大量积累。积累的脯氨酸除作为细胞质内渗透调节物质外，还具有稳定生物大分子结构、降低细胞酸性、解除氨毒和作为能量库调节细胞氧化还原势等功能(王宝增, 2011, 生物学教学, 36 (11): 4-5)。

在旱、盐碱、热、冷处理的逆境条件下，植物体内脯氨酸的含量均明显增加(谢虹等, 2011)。植物体内脯氨酸含量与植物的抗逆性能存在显著相关，抗旱性强的品种的脯氨酸积累较多，因此脯氨酸含量可以作为抗旱育种的主要生理指标(吴慎杰等, 2003)。另外，脯氨酸由于其亲水性极强，能增加原生质胶体稳定性，降低细胞液凝固点，防止细胞脱水, 在低温条件下，植物组织中脯氨酸的大量存在能提高植物的抗寒性，因此，可作为抗寒育种的生理指标(王小华和庄南生, 2008)。

关于脯氨酸测定方法，国内外均有文献报道，Abrahám等(2010)介绍了3种脯氨酸测定方法，分别为靛红试纸检测法、分光光度法和HPLC的氨基酸分析法，其中，靛红试纸检测法主要用于大批样品简单、快速筛选，但显粗糙，HPLC的氨基酸分析法主要基于氨基酸浓度变化，精确好，但设备较为昂贵。而分光光度法成本低、简单、快速，因而最为常用。

针对分光光度法，通常情况下，采用磺基水杨酸提取，在酸性条件下和茚三酮反应生成红色缩合物，用甲苯萃取后，在520 nm处有最大吸收峰(职明星和李秀菊, 2005)。

然而，脯氨酸的分光光度法测定存在一些问题，主要表现：已有的标准曲线范围较小，利用0-10 μg/mL的标准溶液配制，可测脯氨酸含量的范围在0-10 μg/mL，而一般的逆境试验中，脯氨酸含量往往超过15 μg/mL，特殊情况甚至接近75 μg/mL，因而，已有的标准曲线范围不利于逆境处理后期脯氨酸急骤变化的检测。另外，叶片的一般取样量在0.2-0.5 g，也不利于试验室小微量材料的重复取样测定。

转录因子CBF (CRT/DRE-binding factor) 是植物抗逆过程中一个重要的调节因子，其广泛存在于拟南芥 、欧洲油菜、水稻、玉米、小麦等各类植物中，其本身来源于CBF基因，能通过识别COR基因中的CRT/DRE (C-repeat/dehydration-responsive element)元件启动COR基因转录(李科友和朱海兰, 2011; 张瑛等, 2012a)。韩国科学家Oh等(2005)将拟南芥CBF3基因转入粳稻品种Nakdong (转基因5 NT)中，并获得含CBF3基因的转基因3和转基因2材料，进而对含CBF3的转基因材料和对照转基因5 NT的苗期(生长4周)进行干旱胁迫处理，结果表明CBF3基因能显著提高水稻耐旱性。但对干旱胁迫下CBF3与脯氨酸含量的相关性报道较少(张瑛等, 2012b)。

因此，本文通过对脯氨酸测定方法中的最适取样量和标准曲线范围进行研究，并利用不同范围标准曲线，模拟干旱条件，研究CBF3差异水稻材料的脯氨酸含量差异。旨在为探明逆境条件下植物脯氨酸的调控机制提供较好的技术与方法。

1结果与分析
1.1 试验条件的优化
1.1.1 标准曲线的优化
根据赵海泉的脯氨酸测定方法(赵海泉, 2008, 中国农业大学出版社, pp.21-25, 83-84)的10 μg/mL标准溶液进行改进，分别再配制50 μg/mL，100 μg/mL的脯氨酸标准溶液，按表1配制不同浓度的脯氨酸标准溶液。

表1 不同浓度脯氨酸标准溶液配制方法 Table 1 Compound method of standard solution of proline under different concentrations

取17支20 mL具塞刻度试管，分别按表1加入不同浓度的脯氨酸标准溶液，加入2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮显色液，混匀，沸水浴1 h，取出冷却，加入5 mL甲苯，避光静置30 min，用纯水调零在520 nm处测吸光值。试验平行3次，绘制0-75 µg/mL、0-10 µg/mL、15-35 µg/mL、40-75 µg/mL标准曲线(图1)。

图1 脯氨酸标准曲线 注: A: 0-75 µg/mL; B: 0-10 µg/ mL; C: 15-35 µg/mL; D: 40-75 µg/ mL Figure 1 Proline standard curve Note: A: 0-75 µg/mL; B: 0-10 µg/ mL; C: 15-35 µg/mL; D: 40-75 µg/ mL

从上图中可以看出， 如图1B，脯氨酸标准曲线在0-10 µg/mL范围内R²=0.9997，方程y=0.0365x-0.0024，相关性较好，但其范围延展到15-35 µg/mL时(图1C)，R²=0.9974，R²降低，方程y=0.0356x-0.0128，截距变大，即产生误差，而当范围延展至40-75 µg/mL时(图1D)，R²进一步降低为0.991，方程y=0.0387x-0.1716，截距进一步变大，表现为误差进一步增大。而0-75 µg/mL的脯氨酸标准曲线(图1A)正好覆盖上述三段范围，且其R²=0.9983，明显高于15-35 µg/mL、40-75 µg/mL 的R²值，其回归方程为y=0.0359x-0.0095，截距较小。因此，正好解决逆境条件下高脯氨酸浓度检测的准确度问题。

1.1.2脯氨酸测定的最适取样量
分别取0.020 g、0.040 g、0.060 g、0.080 g、0.100 g、0.120 g、0.150 g和0.200 g的未经耐旱处理和耐旱处理30 d的皁籼15水稻叶片，测定脯氨酸含量，设3组平行。绘制脯氨酸含量与水稻叶片重量的曲线图(图2; 图3)。

图2 未经耐旱处理叶片脯氨酸含量和样品取样量的关系 Figure 2 Relationship between leaf Proline content and sampling amount without drought

图3 耐旱处理30天叶片脯氨酸含量与取样量关系 Figure 3 Relationship between leaf proline content and sampling amount ot 30 day under drought

从图2、图3可以看出，无论是未经耐旱处理，还是耐旱处理30 d，虽然其脯氨酸含量的绝对值差异较大，但其曲线都在0.1 g取样量处斜率发生变化，小于0.1 g，表现为脯氨酸含量增加较快，而大于0.1 g，则曲线变平缓，脯氨酸含量增加较慢。因此，0.1 g叶片取样量为脯氨酸含量检测的最适取样量。

1.2干旱胁迫条件下CBF3对脯氨酸含量变化的影响
脯氨酸测定方法优化后，笔者设计1.2.2 干旱处理试验条件，分别定期取样测定其沙土含水量和水势变化，在此基础上，进一步利用含CBF3的转基因2材料和不含CBF3的转基因5 NT材料，研究干旱胁迫条件下CBF3对脯氨酸含量变化的影响。

1.2.1 沙土含水量变化
沙土含水量变化测定如图4所示。

图4 耐旱试验对照组和处理组沙土含水量的变化 Figure 4 Change of water content of sandy soil of control and treatment group under drought

从图4中可以看出，对照组沙土含水量均保持在23%左右，而处理组均从24%下降至5%，下降幅度明显，适宜做耐旱差异试验。

1.2.2 叶片水势变化
不同水稻材料的水势变化如图5所示。

图5 耐旱试验对照组和处理组材料水势变化 Figure 5 Change of water potential of control and treatment group under drought

从图5可以看出，对照组材料和试验组转基因2水势下降幅度较小，差值在0.1-0.2之间。而处理组的转基因5 NT则从-1.27 MPa下降至-2.5 MPa, 差值达到1.23，下降幅度明显。由此表明，CBF3的存在能延缓水势的下降，提高水稻的耐旱性。

1.2.3干旱胁迫条件下的CBF3对脯氨酸含量变化的影响
根据上述沙土含水量和叶片水势的变化，利用图1的不同范围标准曲线的脯氨酸测定方法，进一步研究干旱胁迫条件下的CBF3差异影响下的脯氨酸含量变化(图6)。

图6对照组与处理组脯氨酸含量差异 注: A: 0-10 µg/mL; B: 15-35 µg/mL; C: 40-75 µg/mL; D: 0-75 µg/mL Figure 6 Proline content difference between control and treatment group Note: A: 0-10 µg/mL; B: 15-35 µg/mL; C: 40-75 µg/mL; D: 0-75 µg/mL

 
从图6中均可以看出，对照组材料脯氨酸含量变化不大，而处理组材料差异较大，不含CBF3的转基因5脯氨酸含量增加不明显，与未经干旱处理的对照组脯氨酸含量的变化趋势相近，而含CBF3的转基因2则增加十分明显。由此表明，CBF3可能通过促进脯氨酸增加途径来提高了水稻的耐旱性。

另外，通过图6中的图的进行对比，可以发现，标准曲线范围不同，其计算的脯氨酸含量结果存在较大的差异。以处理组含CBF3的转基因2的脯氨酸含量变化为例(图7)，0-75 μg/mL范围的脯氨酸含量最大增加比例为1081%，如果以0-10 μg/mL范围计算，最大增加比例可达到1417%，大大高于0-75 μg/mL范围，15-35 μg/mL范围的脯氨酸含量最大增加比例为974%，与0-75 μg/mL范围相比有所降低，而40-75 μg/mL范围的脯氨酸含量最大增加比例仅为168.9%，与0-75 μg/mL范围相比则大为降低。由此表明，合适的标准曲线范围对精确测定脯氨酸含量十分重要，范围过小或过大，会造成显示的差异过大或过小，因而直接影响试验结果。

图7 利用不同范围标准曲线计算的处理组转基因2的脯氨酸含量增加比例 Figure 7 Increased proportion of content of Proline to treatment group trangene2 by using of standard curves with different range

2讨论与结论
植物生长的周期性决定了其在整个生长发育过程中将不可避免地遭受到各种生物或非生物的逆境胁迫(简令成和王红, 2009, 科学出版社, pp.115-139; Jaspers and Kangasjärvi, 2010; Bartels and Phillips, 2010; Jewell et al., 2010)。高温、冷害、干旱和盐碱等非生物胁迫对植物造成伤害的主要表现为: 氧化胁迫、生物膜破坏、渗透胁迫和蛋白质变性(简令成和王红, 2009, 科学出版社, pp.115-139; Jacquot, 2009; Ruelland et al., 2009)。植物通常通过调节形态、生理生化、分子和基因等水平的变化来增强对非生物胁迫的抵抗能力，而脯氨酸(proline, Pro)作为一种兼容性小分子, 与水有较好的亲和力,每升水中能溶解1623 g 脯氨酸, 并且高浓度对细胞无毒性, 对细胞的酸碱平衡无影响(刘学师等, 2002; Xue et al., 2009; Lehmann et al., 2010; Szabados and Savouré, 2010)。研究表明, 游离的脯氨酸对植物细胞抵抗非生物胁迫中起重要作用, 而且，其越来越多新的生理功能正在被发现, 近年来关于脯氨酸的调控机制研究倍受科学家的关注(Xue  et al., 2009; Lehmann et al., 2010; Szabados and Savouré, 2009; Verbruggen and Hermans, 2008; Trovato et al., 2008)。

然而，目前实验指导书中的脯氨酸的测定方法使用期大都在10年以上(刘友良, 1992, 农业出版社, pp.84-89; 邹琦, 1995, 中国农业出版社, pp.96-97; 李合生, 2000, 高等教育出版社, pp.258-260; 张志良, 1990, 高等教育出版社, pp.259-260; 白宝璋和汤学军, 1993, 中国科学技术出版社, pp.156-157; 龚富生和张嘉宝, 1995, 气象出版社, pp.256-259)。职明星和李秀菊(2005)对脯氨酸测定方法的显色时间、酸性茚三酮与脯氨酸反应的关系、酸性茚三酮溶液保存时间与贮藏温度的关系进行研究，但未对标准曲线和样品取样量进行优化。

本文以水稻叶片为试验材料，首先对标准曲线(表1; 图1)进行优化比较，获得0-75 μg/mL的脯氨酸含量范围的标准曲线，y=0.0359x-0.0095，R²=0.9983。其次，利用未经耐旱处理和耐旱处理30 d的水稻材料，研究取样量与脯氨酸含量的相关性，获得0.1 g最适取样量(图2; 图3)。在此基础上，模拟耐旱试验条件(图4; 图5, 沙土含水量及叶片水势变化)，利用脯氨酸含量的不同范围的标准曲线和最适取样量通过研究干旱胁迫处理下CBF3差异水稻材料脯氨酸含量变化(图6)，比较不同标准曲线范围对脯氨酸含量增加比例的影响(图7)。研究结果表明：干旱胁迫处理下，CBF3的存在能显著促进脯氨酸含量的增加并减缓植物水势的下降，而合适的标准曲线范围对精确测定脯氨酸含量十分重要。

本研究通过对脯氨酸测定方法中的最适取样量和标准曲线范围进行研究，并利用不同范围标准曲线，结合逆境条件下的CBF3差异水稻材料的脯氨酸含量变化，从而证明测定脯氨酸含量需要有最适取样量和合适的标准曲线范围。研究为逆境条件下植物脯氨酸测定提供较好的技术与方法。

3材料与方法
3.1试验材料
方法优化试验的取样材料早籼15由安徽省农科院水稻所提供，含CBF3的转基因2和不含CBF3的转基因5 NT (为转基因2的野生型)由韩国明知大学生命科学学院提供。

3.2试验方法
3.2.1脯氨酸测定
脯氨酸测定的方法参照(赵海泉, 2008, 中国农业大学出版社, pp.21-25, 83-84)进行修改，主要如下：①提取液3%磺基水杨酸水溶液：称取3.00 g磺基水杨酸，溶解，定容至100 mL容量瓶中；②反应液2.5%酸性茚三酮显色液：量取13.8 mL磷酸，加水至20 mL，为6 mol/L磷酸，加30 mL冰乙酸，混匀作为溶剂。称取1.25g茚三酮，置于50 mL棕色容量瓶中，加入溶剂，70摄氏度水浴溶解1 h，完全溶解后，冷却至室温，定容，转移于棕色瓶中保存，此溶液在4℃下可存放20 d。③脯氨酸的提取：将水稻叶片去除中脉，剪碎，精确取0.1000 g (最适取样量见结果2.1.2)，置于10 mL具塞刻度试管中，加入5 mL 3%磺基水杨酸溶液，盖紧试管塞，沸水浴10 min。脯氨酸的测定：取出冷却至室温，取2 mL上清液于20 mL具塞刻度试管，加入2 mL冰醋酸和3 mL酸性茚三酮显色液，沸水浴1 h。取出冷却后，加入5 mL甲苯充分振荡，避光静置30 min，以纯水调零，在520 nm处测定吸光值。试验设3次重复，误差值均小于1%。

3.2.2干旱处理试验条件设计
参照张瑛等(2012b)。试验于2012年4月至7月在安徽省水稻遗传育种重点实验室完成。采用人工盆栽控制水分的方法，栽苗用底部带孔的圆形盆钵，其直径20 cm，上部直径31 cm，盆深33 cm，盆钵则放在宽40 cm、长60 cm、高30 cm的长方形塑料盆中，在每个圆盆钵底部放上2层滤纸，再装入吸水性较好的经过清洗、烘干处理并先后过直径4 cm和1.5 cm×20 cm筛的细沙土15 kg。试验使用全营养液参照菲律宾国际水稻所配方(程维民等, 2011)。

试验分对照组和处理组，设4个重复，4月1日滤纸催芽，待苗长至0.5寸左右进行移栽至圆盆钵中，平均每3天1次将全营养液放入长方形塑料盆中，以确保水稻正常生长。在干旱试验处理开始时，对照组则改营养液为加去离子水，使其正常生长。干旱处理组则停止加入营养液和去离子水，处理时间15 d，自6月15日至6月31日(必要时, 用喷洒少许去离子水以防止其枯死)。每隔3天取1次叶片样品测定脯氨酸含量，共取5次，其中，每次取样的脯氨酸增加比例(%)=(该次脯氨酸含量-第1次脯氨酸含量)×100/第1次脯氨酸含量。同时测定其沙土水分含量和叶片的水势。
另外，用于脯氨酸测定优化的早籼15的耐旱方法处理同上，处理时间为5月15日至6月15日。

3.2.3沙土水分含量测定
参照张瑛等(2012b)，上午九点半点取样，取盆内沙表面以下5cm处样，共取5个散点，散点均匀分布，取好的沙置于小烧杯内，并精确快速称取10.0g，在80℃烘至恒温称重，计算相对含水量。计算公式如下：
相对含水量(%)=(湿沙土重量-干沙土重量)*100/干沙土重量

3.2.4叶片的水势测定
参照赵海泉的测定方法(赵海泉, 2008, 中国农业大学出版社, pp.21-25, 83-84)。

作者贡献
张瑛和周俊峰是本研究的实验设计和实验研究的执行人；张瑛、周俊峰完成数据分析，论文初稿的写作；施伏芝、阮新民、滕斌、吴敬德参与实验设计，试验结果分析；张瑛和罗志祥是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由科技部国际合作项目(2010DFA31950)，国家863项目(2012AA101103)，973计划前期研究专项(2011CB111506)，安徽省自然科学基金项目(11040606M97)资助。

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